Ingeniería de bacterias para aplicaciones biomédicas

Investigador Principal: LUIS A. FERNÁNDEZ HERRERO

Nuestra investigación se centra en la ingeniería de bacterias E. coli para aplicaciones biomédicas, incluyendo la selección de anticuerpos recombinantes de pequeño tamaño y el diseño de bacterias para su uso in vivo en diagnóstico y terapia. Estudiamos sistemas de secreción de proteínas que se encuentras en cepas patogénicas de E. coli y los modificamos mediante ingeniería para convertirlos en nanomáquinas que puedan ser útiles en la selección y expresión de anticuerpos recombinantes y otras proteínas de interés terapéutico en cepas no patógenas de E. coli. Entre los anticuerpos recombinantes empleamos anticuerpos monodominio (sdAb) o nanobodies, que son los fragmentos más pequeños conocidos derivados de anticuerpos con capacidad de reconocer un antígeno con alta afinidad y especificidad. Los nanobodies se basan en dominios VHH obtenidos a partir de anticuerpos de sólo cadenas pesadas presentes en camélidos (por ejemplo, dromedarios, llamas). Usamos aproximaciones de biología sintética e ingeniería de genomas para combinar la expresión de estos módulos en la bacteria diseñada.

 

Proyectos actuales:

 

1) Selección de nanobodies desde genotecas expresadas en la superficie de E. coli. Los proteínas que pertenecen a los sistemas de secreción tipo V (T5SS), como las familias de Intimina-Invasina y de los autotransportadores, tienen la capacidad de autotransportarse a través de las membrana externa bacteriana. Hemos modificado mediante ingeniería los dominios de transporte de proteínas T5SS para expresar nanobodies en la superficie de E. coli y estamos empleando esta tecnología para seleccionar clones de alta afinidad frente a antígenos relevantes en procesos de infección y patologías humanas.

 

2) La reprogramación de la adhesión de E. coli con adhesinas sintéticas hacia tumores. La presentación de nanobodies en la superficie de E. coli nos ha permitido generar "adhesinas sintéticas" que dirigen la unión de las bacterias a superficies diana con un antígeno reconocido por estas adhesinas, incluyendo células tumorales que expresan antígenos en la superficie celular. Hemos demostrado que se pueden colonizar tumores de forma eficiente in vivo con dosis bajas de E. coli modificadas con adhesinas sintéticas que reconocen un antígeno expresado en la superficie de las células tumorales.

 

3) Inyección de proteínas terapéuticas a células humanas con E. coli. Estamos explotando el sistema de secreción de proteínas tipo III (T3SS) presente en cepas enteropatógenas de E. coli (EPEC) para inyectar directamente proteínas de potencial terapéutico y nanobodies desde E. coli al citoplasma de las células humanas. Durante la infección, estos T3SS filamentosos actúan como jeringas moleculares (inyectisomas) para la translocación de las proteínas desde la bacteria a la célula de mamífero. Hemos modificado la expresión de los inyectisomas de EPEC en la cepas no patógena E. coli K-12. La inyección de nanobodies por E. coli no requiere la invasión bacteriana de la célula eucariota o la transferencia de material genético.

 

Figura 1.(A) Esquema de los anticuerpos IgG convencionales con cadena pesada (H) y ligera (L) el fragmento cristalizable constante (Fc) y los dominios variables (V) y constantes (C). Se muestran también los fragmentos de anticuerpo con actividad de unión a antígeno, Fab y monocadena Fv (scFv). (B) Representación esquemática de los anticuerpos de cadena pesada de camelidos y los fragmentos monodominio (VHH) denominados nanobodies.

 

Figura 2. Esquema mostrando el proceso de selección de nanobodies mediante E. coli display. Los segmentos VHH se amplifican desde los linfocitos de dromedarios inmunizados y se clonan en un vector con el dominio Β de Intimina para su expresión en la superficie de E. coli. Estas bacterias se incuban con antígeno diana marcado con biotina y a continuación con partículas magnéticas recubiertas con un mAb anti-biotina. Los clones que unen el antígeno se capturan en imanes con columnas de magnetic cell sorting (MACS) y se plaquean para su crecimiento posterior.

 

Figura 3. Imagen de microscopía confocal de fluorescencia mostrando a bacterias E. coli (en rojo) con adhesinas sintéticas dirigidas hacia una antígeno (en verde) expresado en la superficie de células tumorales humanas (DNA de núcleos y bacterias teñidos en azúl).

 

Figura 4. Esquema ilustrando la translocación de proteínas a células de mamífero con bacterias SIEC (Synthetic Injector E. coli) modificadas para expresar los inyectisomas filamentosos del sistema de secreción tipo III de EPEC.